ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΥΛΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΥ ΕΡΓΟΥ
(α) In silico σχεδιασμός βελτιστοποιημένων αναλόγων του μορίου Amy22 Η βελτιστοποίηση μοριακών δομών (με σκοπό την βελτίωση φυσικοχημικών και φαρμακολογικών ιδιοτήτων και της δραστικότητας του μορίου ΑΜΥ22) θα πραγματοποιηθεί με δύο διαφορετικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούν τεχνολογίες αιχμής υπολογιστικού σχεδιασμού φαρμάκων οι οποίες στηρίζονται 1) στη δομή γνωστών αναστολέων του συμπλόκου ΜΥC/ΜΑΧ και 2) στην τρισδιάστατη δομή του Μyc (Hammoudeh et al., 2009). Στην πρώτη προσέγγιση θα χρησιμοποιηθούν: (1) Ενα πρωτόκολλο που έχουμε αναπτύξει με βάση την ένωση-οδηγό Αmy22 που ανήκει στην οικογένεια των πυραζολο-πυριμιδινών. Η τρισδιάστατη χημική ομοιότητα και τα φαρμακοφόρα στοιχεία του Αmy22 θα χρησιμοποιηθούν για την ανακάλυψη νέων αναστολέων MYC/MAX διμερισμού σε πιστοποιημένες χημειοθήκες μορίων PubChem (30 εκατομμύρια μόρια), ZINC (2 εκατομμύρια μόρια), NCI, ΗΠΑ (140 χιλιάδες μόρια) (Εικονα 3Α). (2) Επέκταση του Αmy22 με βάση την ευθυγράμμισή του με τον ΜYC αναστολέα ΚJ-Pyr-9 (Εικονα 1Β). (3) Τρισδιάστατα φαρμακοφόρα μοντέλα χρησιμοποιώντας γνωστούς MYC αναστολείς από τη βιβλιογραφία και το λογισμικό Phase. Το μοντέλο φαρμακοφόρου χρησιμοποιείται στη συνέχεια για να αναγνωριστούν τμήματα του Αmy22 που μπορεί να αντικατασταθούν προς βελτιστοποίηση από μεγάλες βιβλιοθήκες ενώσεων που ταιριάζουν με τα κριτήρια φαρμακοφόρου (Εικόνα 3Γ). Εκτός από την ένωση Amy22, παράλληλη εικονική αξιολόγηση οδήγησε στην ανακάλυψη ενός παραγώγου θειουρίας, της ενώσεως Myci19, η οποία απεδείχθη ότι συνδέεται με την πρωτεΐνη MYC με Kd=2.7±0.7 μΜ. Η διαδικασία βελτιστοποίησης έχει ήδη αρχίσει και, με βάση την δομική ομοιότητα, έχουν επιλεγεί 40 ενώσεις από την χημειοθήκη του Αναπτυξιακού Θεραπευτικού Προγράμματος (DTP) του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου ΗΠΑ (NCI) και 40 ενώσεις από μία χημειοθήκη του Τμήματος Φαρμακευτικής του ΕΚΠΑ. Η σύνδεση των μορίων με την πρωτεΐνη MYC εξετάζεται με την βιοφυσική τεχνική διαφορικής φθορισμομετρίας σάρωσης (Differential Scanning Fluorimetry, DSF). Προς αποφυγήν επαναλήψεων, τονίζεται ότι όλες οι πειραματικές προσεγγίσεις που περιγράφονται κατωτέρω (σύνθεση ενώσεων, βιοχημική και βιολογική αξιολόγηση κλπ.) αφορούν παράγωγα βελτιστοποίησης αμφοτέρων των ενώσεων-οδηγών Amy22 και Myci19. Στη δεύτερη προσέγγιση (μέσω της δομής της πρωτεΐνης MYC) θα ληφθεί υπόψη η τρισδιάστατη δομή της MYC όπως έχει προσδιοριστεί από μελέτες NMR (Hammoudeh et al., 2009). Για το μόριο Αmy22 θα οπτικοποιηθούν και θα εξεταστούν αναλυτικά οι αλληλεπιδράσεις του σε σημεία πρόσδεσης της MYC πρωτεΐνης. Για βελτιστοποίηση της μοριακής δομής θα ληφθούν υπόψη ποικίλοι υποκαταστάτες που θα τοποθετηθούν υπολογιστικά μέσω του λογισμικού BOMB. Π.χ. προσθήκη αμιδίου στη θέση οξέος του Αmy22 είναι πιθανό ότι θα βελτιώσει την δραστικότητα. Τέτοιες τροποποιήσεις θα επεκταθούν στην εισαγωγή ετεροατόμων στους οργανικούς δακτυλίους (άζωτο, οξυγόνο, θείο) και θα εξεταστούν και άλλοι υποκαταστάτες όπως η κυανική ομάδα, φθόριο, μεθόξυ κλπ. Οι συνδέτες δύο τμημάτων των μορίων-οδηγών (linkers) θα μελετηθούν προσεκτικά και θα εισαχθούν κετοομάδες, αιθερομάδες, θειοομάδες κ.ά. Ενδεικτικά αναφέρουμε ως παράδειγμα επιτυχημένης υπολογιστικής βελτιστοποίησης ότι σε προηγούμενες μελέτες μας με στόχο την ογκοπρωτεϊνη MIF μία ένωση- οδηγός με αρχική δραστικότητα 1,5 μM εξελίχθηκε ταχύτατα σε βελτιστοποιημένη ένωση με ενεργότητα 10 nM. H διαφορά των δύο ενώσεων ήταν μία υδροξυλική ομάδα (Cournia et al., 2009; Hare et al., 2010). Παράλληλα θα εξεταστούν οι φυσικοχημικές ιδιότητες των υποψηφίων ενώσεων για να αναγνωριστούν νωρίς τυχόν ανεπιθύμητες ιδιότητες απορρόφησης, κατανομής στον οργανισμό, μεταβολισμού, και απέκκρισης (Egan et al., 2000), ώστε να περιοριστούν οι δαπάνες για περιττές περαιτέρω αξιολογήσεις. Αυτός ο έλεγχος θα γίνει με τη βοήθεια του λογισμικού QikProp, το οποίο μπορεί να υπολογίσει γρήγορα και αξιόπιστα χημικές και φυσικοχημικές ιδιότητες υποψηφίων φαρμάκων, όπως η κυτταρική διαπερατότητα, η λιποφιλία και η υδατοδιαλυτότητα, και επιπλέον έχει την δυνατότητα να προβλέψει ποιοι υποκαταστάτες μπορούν να αποβούν μεταβολικά ασταθείς. Επιπρόσθετα, θα λάβουμε υπόψη για τις ενώσεις-οδηγούς τον «κανόνα των 5» (μοριακό βάρος 500, λιποφιλία 5, δότες δεσμού υδρογόνου 5, και δέκτες δεσμού υδρογόνου 10, Lipinksi et al., 2001) . Ο πίνακας φαρμακομοριακών ιδιοτήτων θα διευρυνθεί με μεταβλητές που θα περιλαμβάνουν 2-D και 3-D παραμέτρους. 2-D θα θεωρηθούν συντακτικές, τοπολογικές και ηλεκτροτοπολογικές παράμετροι που θα υπολογιστούν με βάση τα λογισμικά Dragon και MOLCONNZ. Για τον υπολογισμό των παραμέτρων 3-D τα μόρια θα υποβληθούν σε γεωμετρική βελτιστοποίηση με ελαχιστοποίηση της ενέργειας μέσω των προγραμμάτων Spartan και HyperChem.
A) Ευθυγράμμιση του μορίου ΑΜΥ22 (μωβ) με βάση την τρισδιάστατη χημική ομοιότητα στα φαρμακοφόρα σημεία με υποψήφιο αναστολέα (πράσινο) από υπάρχουσες χημειοθήκες. Β) Επέκταση του μορίου Αmy22 (μωβ) με βάση την τρισδιάστατη χημική ομοιότητα στα φαρμακοφόρα σημεία με τον γνωστό αναστολέα KJ-Pyr-9 (πορτοκαλί). Γ) φαρμακοφόρα σημεία στη δομή του Mycro3 (δέκτης δεσμού υδρογόνου, ροζ βέλος), δότης δεσμού υδρογόνου (γαλάζιο βέλος), υδρόφοβη περιοχή (πράσινη σφαίρα) και αρωματικός δακτύλιος (καφέ δακτύλιος).
(β) Σύνθεση νέων μορίων με αναμενόμενη αντι-MYC δράση Για δομικές τροποποιήσεις και σύνθεση παραγώγων ή αναλόγων της οδηγού-ενώσεως Amy22, θα εφαρμοστεί υψηλού επιπέδου σύγχρονη μεθοδολογία συνθετικής οργανικής χημείας (state-of-the-art) προκειμένου να αναπτυχθούν ταχέα και αποδοτικά σχήματα χημικών οδών με δυνατότητες εύκολης διαποικίλησης. Στρατηγικές συνδυαστικής χημείας με χρήση στερεού υποστρώματος μπορούν να εφαρμοστούν για τη σύνθεση παραλλαγών ενός συγκεκριμένου φαρμακοφόρου (του τύπου των ενώσεων Amy22 και Myci19). Περαιτέρω βελτιστοποίηση των πιο ενεργών ενώσεων αναμένεται να επιτευχθεί μετά από επαναληπτικές εφαρμογές της διαδικασίας. Στο στάδιο της τελικής επιλογής υποψηφίων φαρμάκων, οι συνθετικές οδοί θα βελτιστοποιηθούν με στόχο υψηλές αποδόσεις από αλληλουχίες αντιδράσεων αναπαραγώγιμης επιτυχίας, ούτως ώστε να επιτευχθούν συνθέσεις σε μεγάλη κλίμακα (scale up) και να εξασφαλιστεί η παραγωγή υλικού σε ποσότητα επαρκή για τις ανάγκες των προκλινικών δοκιμών. Ο καθαρισμός των τελικών προϊόντων θα γίνει με κρυστάλλωση, καθίζηση ή/και χρωματογραφικό διαχωρισμό (δηλ. στήλες, ΗΡ ή MPLC). Ένας γενικά αποδεκτός βαθμός καθαρότητας θα είναι 97% και άνω. Η ταυτοποίηση δομής θα γίνει με πρότυπες αναλυτικές τεχνικές, όπως NMR, IR, MS/HRMS κλπ.
(γ) Βιοφυσική/Βιοχημική διερεύνηση της απευθείας σύνδεσης νέων μορίων με MYC ή/και ΜΑΧ Για να πιστοποιηθεί ότι ο μηχανισμός της αναμενόμενης αντι-MYC ανασταλτικής δράσης των νέων μορίων είναι η άμεση σύνδεσή τους (direct binding) με την MYC ή/και την ΜΑΧ ογκοπρωτεΐνη με αποτέλεσμα παρεμπόδιση του σχηματισμού MYC/ΜΑΧ συμπλόκου, θα χρησιμοποιηθεί συνδυασμός συμπληρωματικών βιοχημικών και βιοφυσικών τεχνικών. Για εφαρμογή αυτών των μεθόδων, έχουμε ήδη παραγάγει σε βακτηριακές καλλιέργειες τα απαραίτητα bHLHZ τμήματα των πρωτεϊνών (MYC αμινοξέα 353-437 και MΑΧ αμινοξέα 22-102), ως ανασυνδυασμένα πολυπεπτίδια με προσδέματα πολυιστιδίνης (His-6) και τα απομονώσαμε με χρωματογραφία συγγένειας. Μία ταχύτατη μέθοδος που θα εφαρμοστεί είναι η διαφορική φθορισμομετρία σάρωσης (Differential Scanning Fluorimetry, DSF), η οποία αξιολογεί την σύνδεση πρωτεϊνών με μικρά μόρια με βάση τη μεταβολή της θερμικής τους σταθερότητας. Για λεπτομερή χαρακτηρισμό και ποσοτικοποίηση θα μετρηθεί (με φθορισμόμετρο Hitachi) τόσο η ανισοτροπία φθορισμού (Fluorescence Polarization/Anisotropy) των μορίων παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης (MYC ή MAX), όσο και η ένταση της εκπομπής φθορισμού της πρωτεΐνης παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων αναστολέων (Hammoudeh et al., 2009). Η συγγένεια αλληλεπίδρασης θα εκτιμηθεί από την καταγραφή καμπυλών πρόσδεσης. Για να επιβεβαιωθεί ποιοτικά η ικανότητα των νέων μορίων να αναστέλλουν τόσο το σχηματισμό του συμπλόκου MYC/MAX, όσο και την σύνδεσή του με DNA (E-boxes), θα χρησιμοποιηθεί δοκιμασία ανίχνευσης της μεταβολής της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του συμπλόκου μετά από τη σύνδεση/αποσύνδεσή του με ολιγονουκλεοτίδια αναγνωριστικής αλληλουχίας (electrophoretic mobility shift assays; Follis et al., 2009). Τα αποτελέσματα της ηλεκτροφόρησης θα ανιχνευθούν με ανοσοαποτύπωση (Western analysis). Για την ίδια αξιολόγηση θα χρησιμοποιηθεί επίσης δοκιμασία συγκατακρήμνισης (pull-down), κατά την οποία η πρωτεΐνη His-MYC θα επωαστεί με MAX παρουσία των νέων χημικών μορίων. Μετά από κατακρήμνιση MYC με σφαιρίδια νικελίου, θα ελεγχθεί με ανοσοαποτύπωση αν έχει παρεμποδιστεί η συγκατακρήμνιση της πρωτεΐνης MΑΧ, δηλαδή αν έχει δράσει το ανασταλτικό μόριο. Άμεση επιβεβαίωση για την παρεμπόδιση (ή μη) της σύνδεσης MYC και ΜΑΧ από τα νέα μόρια θα προκύψει από πειράματα φασματοπολωσιμετρίας (με Jasco J-810) Κυκλικού Διχρωισμού (Circular Dichroism, CD; Follis et al., 2008, Hammoudeh et al. 2009), που βασίζεται στο γεγονός ότι αυτές οι δύο πρωτεΐνες εμφανίζουν εγγενή αταξία (intrinsically disordered proteins) και υιοθετούν σταθερή δευτεροταγή και τριτοταγή δομή μόνο μετά τον ετεροδιμερισμό τους. Φάσματα CD της MYC, της MAX και ισομοριακού μείγματος MYC/MAX θα καταγραφούν απουσία και παρουσία των υπό εξέταση αναστολέων.
(δ) In vitro αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των νέων μορίων/Αξιολόγηση συνοδευτικού βιοδείκτη MYC Η αποτελεσματικότητα των νέων μορίων θα αξιολογηθεί in vitro με πειράματα υψηλής απόδοσης (high throughput) σε 50 κυτταρικές σειρές μελανώματος και καρκίνων παγκρέατος, μαστού, και πνεύμονος. Τα κύτταρα (5000 ανά φρεάτιο σε τετράγωνα τρυβλία με 384 φρεάτια) θα επωαστούν στους 37oC για 6 ώρες ώστε να προσκολληθούν. Θα ακολουθήσει προσθήκη μορίων σε 8 διαφορετικές συγκεντρώσεις καθώς και γνωστών αντικαρκινικών φαρμάκων στοχευμένης θεραπείας, για σύγκριση. Ένα σύστημα μόνιμης παρακολούθησης ζωντανών κυττάρων (live cell monitoring system - Juli Stage) θα χρησιμοποιηθεί για έλεγχο της κυτταρικής ανάπτυξης επί 48 ώρες (1 εικόνα ανά φρεάτιο ανά 30′). Μετά το πέρας της επώασης θα αξιολογηθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων με δοκιμασία Resazurin. Θα γίνει επίσης αξιολόγηση ζωντανών/νεκρών κυττάρων με Propidium Iodide, Calcein AM και Hoechst (δοκιμασία υψηλής απόδοσης με ανάλυση 3 χρωμάτων, high content screening). Παρράληλα θα εξεταστεί in-vitro εάν τυχόν υπερέκφραση του MYC στις 50 κυτταρικές σειρές συσχετίζεται με ανταπόκριση σε αντι-MYC μόρια με σκοπό την επιλογή του MYC ως συνοδευτικού βιοδείκτη.
(ε) In vitro αξιολόγηση της τοξικότητας των νέων μορίων Πρωτογενή ανθρώπινα ηπατοκύτταρα (5000 ανά φρεάτιο) θα καλλιεργηθούν σε τρυβλία 96 φρεατίων στους 37oC για 24 ώρες με παρακολούθηση από το σύστημα παρακολούθησης ζωντανών κυττάρων και μετά θα προστεθούν χημικές ενώσεις και θα παρατηρηθεί η κυτταρική ανάπτυξη [βλ. (δ), ανωτέρω]. Μετά από 24 ώρες, θα αξιολογηθεί η βιωσιμότητα των ηπατοκυττάρων με ποσοτική δοκιμασία κυτταροτοξικότητας LDH, ενώ το οξειδωτικού stress θα προσδιοριστεί με τη διαδικασία CM-H2DCFDA και με μέτρηση φθορισμού (Varioskan LUX multimode microplate reader).
(στ) In vitro ανάλυση δράσεων των νέων μορίων στην κυτταρική σηματοδότηση Ανάλυση των επιδράσεων των ενώσεων Amy22 και Myci19 και των παραγώγων τoυς στην κυτταρική σηματοδότηση και σύγκριση με καθιερωμένα αντικαρκινικά φάρμακα ειδικά για κάθε είδος όγκου θα γίνει χρησιμοποιώντας καλλιέργειες κυτταρικών σειρών μελανώματος και καρκίνων παγκρέατος, μαστού και πνεύμονος. Τα κύτταρα (5000 ανά φρεάτιο) θα καλλιεργηθούν σε τρυβλία 96 φρεατίων στους 37oC επί 6 ώρες για προσκόλληση και θα παρακολουθούνται (δες ανωτέρω). Στη συνέχεια, θα προστεθούν ενώσεις επιλεγμένες σε προηγούμενη φάση λόγω αποτελεσματικότητας καθώς και αντικαρκινικά φάρμακα στοχευμένης θεραπείας σε 8 διαφορετικές συγκεντρώσεις με ταυτόχρονη παρακολούθηση της κυτταρικής ανάπτυξης. Μετά από επώαση 48 ωρών, θα γίνει λύση των κυττάρων και συλλογή πρωτεϊνών. Για την ανάλυση των δράσεων στην κυτταρική σηματοδότηση θα μετρηθούν ~20 φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες με τη δοκιμασία Luminex (πολυπλεκτική τεχνολογία ELISA). Μεταβολές στα σηματοδοτικά μονοπάτια από την δράση νέων μορίων (σε σύγκριση με πειράματα ελέγχου, controls) θα προσδιοριστούν μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης και ακέραιου γραμμικού προγραμματισμού (Mitsos et al., 2009). Παράλληλα θα εξεταστεί και ο μηχανισμός δράσεως αντικαρκινικών φαρμάκων με γνωστά κλινικά αποτελέσματα που είτε θεωρούνται «καλύτερα κατά κατηγορία» (best-in-class) είτε έχουν αποτύχει σε κλινικές δοκιμές. Υπολογιστικές τεχνικές μηχανικής μάθησης (machine learning /support vector machine) θα συσχετίσουν τον τρόπο δράσεως των μορίων με την κλινική αποτελεσματικότητα (Mitsos et al., 2009; Morris et al., 2014) ) και θα δώσουν ένα σκορ για την πιθανή αποτελεσματικότητά των υπό εξέταση μορίων σε μελάνωμα και καρκίνους παγκρέατος, μαστού και πνεύμονος. Η προσέγγιση αυτή έχει λάβει βραβείο καλύτερης τεχνικής στο διεθνές συνέδριο BIO-IT στην Βοστώνη και έχει πατενταριστεί (US 20110153302 A1) από την ομάδα του Συντονιστή Δρ. Αλεξόπουλου στο MIT.
(ζ) Ιn vitro καθορισμός του μεταβολικού προφίλ των νέων μορίων Ο προσδιορισμός του μεταβολικού προφίλ είναι καίριας σημασίας κατά την φαρμακολογική αξιολόγηση καινοτόμων βιοδραστικών ουσιών, καθώς συσχετίζεται με την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια του φαρμάκου. Επειδή το ήπαρ παίζει καίριο ρόλο στον μεταβολισμό των ξενοβιοτικών, θα διερευνηθεί ο μεταβολισμός του Amy22 και των άλλων αντι-MYC μορίων χρησιμοποιώντας ηπατικά μικροσώματα (ανθρώπου) που θα επωαστούν με τα υπό μελέτη φάρμακα παρουσία και απουσία κατάλληλων συμπαραγόντων (π.χ. β-NaDPH). Η ανάλυση των δειγμάτων θα πραγματοποιηθεί με χρήση υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μετά από 1) εκχύλιση των παραγόμενων μεταβολιτών, 2) προσδιορισμό του μεταβολικού προφίλ με εξειδικευμένα πειράματα LC-MS/MS (π.χ. Information Dependant Acquisition), και 3) υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας, LC-MS/MS, για τον ποσοτικό προσδιορισμό των μεταβολιτών έπειτα από επώαση με τα μικροσώματα, ώστε να υπολογιστεί η μεταβολική σταθερότητα των υπό μελέτη ουσιών.
(η) In vivo φαρμακολογικές αναλύσεις των νέων μορίων Για την φαρμακοκινητική αξιολόγηση σε ποντίκια των τελικά επιλεγμένων υποψηφίων αντι-ΜΥC φαρμάκων θα γίνουν μετρήσεις των συγκεντρώσεων των υπό μελέτη μορίων και των μεταβολιτών τους σε πλάσμα (ή ολικό αίμα) χρησιμοποιώντας μεθοδολογία υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (LC- MS/MS). Οι μετρήσεις θα οδηγήσουν στον καθορισμό των παραμέτρων AUC, Cmax, tmax που είναι οι πλέον κοινώς χρησιμοποιούμενες για την παροχή πληροφοριών σχετικά με απορρόφηση, κατανομή, μεταβολισμό και απέκκριση. Η διαλυτότητα των ενώσεων που παρουσιάζουν ενδιαφέρον θα εξεταστεί σε διάφορα μέσα (π.χ. σε φυσιολογικό ορό, καρβοξυμεθυλοκυτταρίνη κλπ.) για να καθοριστεί η ενδοπεριτοναϊκή (IP) ή από του στόματος (PO) χορήγησή τους στα πειραματόζωα. Για ποσοτικοποίηση του φαρμάκου και των μεταβολιτών του, θα συλλέγονται δείγματα αίματος σε τακτά χρονικά διαστήματα μετά από την χορήγηση (π.χ., t = 15 min, 1, 2, 4, 8 ώρες μετά τη δόση) με ένα πρωτόκολλο που προβλέπει διαδοχικές αιμοληψίες από την ουρά (tail serial bleeding). Η βέλτιστη δόση θα προσδιοριστεί με κατάλληλες δοκιμές, λαμβάνοντας υπόψη την γνωστή δραστική δόση της ενώσεως Amy22 (100 mg/kg) σε συνδυασμό με τις τιμές IC50 που θα καθοριστούν από τα in vitro πειράματα υψηλής απόδοσης και τις πληροφορίες που θα προκύψουν από τις φαρμακοκινητικές αναλύσεις. Καθώς το πρόγραμμα εξελίσσεται, στις περιπτώσεις ενώσεων με θεραπευτικό αποτέλεσμα, θα γίνει συλλογή πλάσματος ή αίματος και όγκων, προκειμένου να εξεταστεί η κατανομή στους ιστούς-στόχους. Παράλληλα, θα γίνει αξιολόγηση πιθανής τοξικότητας στο ήπαρ (μέτρηση ηπατικών ενζύμων στο αίμα).
(θ) Προκλινική μελέτη υποψηφίων αντι-ΜΥC φαρμάκων Η προκαθορισμένη τριετής διάρκεια του προγράμματος και το επιτρεπτό ύψος της επιχορηγήσεως θέτουν αυστηρούς περιορισμούς στον αριθμό των επιδιώξεων που μπορούν ρεαλιστικά να επιτευχθούν. Με αυτά τα δεδομένα και με βάση την εκτεταμένη πείρα μας, έχουμε επιλέξει στην εφαρμογή του συνολικού προγράμματος, που συμπεριλαμβάνει προκλινικές μελέτες, όχι περισσότερους από 4 τύπους καρκίνου (μελάνωμα και καρκίνους του παγκρέατος, μαστού και πνεύμονος), που όμως επαρκούν για χαρακτηριστική τεκμηρίωση της αντι-MYC θεραπευτικής αγωγής. Η επιλογή μας είναι πλήρως αιτιολογημένη, και στην περίπτωση του παγκρεατικού καρκίνου αυτονόητη, εφόσον έχουμε ήδη τεκμηριώσει τον ηγετικό ρόλο της ομάδας μας στο πεδίο αυτό, ενώ η βιβλιογραφία αναφέρει με έμφαση τον ρόλο του MYC και την θεραπευτική του στοχοποίηση στον καρκίνο του παγκρέατος που είναι ο πλέον θανατηφόρος (βλ. π.χ. Wirth et al., 2016; Hessmann et al., 2016). Στον καρκίνο του μαστού, που είναι για τις γυναίκες ο δεύτερος σε συχνότητα θανάτων, το ογκογονίδιο MYC υπερεκφράζεται στο 40% των περιπτώσεων και εμφανίζει γονιδιακή πολλαπλότητα (amplification) τουλάχιστον στο 15% των περιπτώσεων (Efstratiadis et al., 2007). Μάλιστα, η υπερέκφραση του MYC σχετίζεται με χείριστη πρόγνωση στον «τριπλά αρνητικό» καρκίνο του μαστού (έλλειψη υποδοχέων οιστρογόνων, προγεστερόνης και HER2) που είναι εξαιρετικά κακοήθης, στερείται στοχευμένης θεραπείας, και εξακολουθεί να αποτελεί άλυτο κλινικό πρόβλημα (Gupta et al., 2017). Ο καρκίνος του πνεύμονος είναι η συχνότερη αιτία θανάτου από καρκίνο και για τα δύο φύλα. Το MYC εμφανίζει γονιδιακή πολλαπλότητα σε 20% των περιπτώσεων του πλέον επιθετικού μικροκυτταρικού καρκίνου (10-15% του συνόλου) και σε 10% των περιπτώσεων μη μικροκυτταρικού καρκίνου (80-85% του συνόλου). Δεδομένου ότι 25-35% των μη μικροκυτταρικών περιπτώσεων σχετίζονται με μετάλλαξη KRAS και έχουν κακή πρόγνωση, η ογκοπρωτεΐνη MYC εμφανίζεται ως πολλά υποσχόμενος θεραπευτικός στόχος. Τέλος, η MYC ογκοπρωτεΐνη υπερεκφράζεται σε 40% των περιπτώσεων δερματικού μελανώματος (Lin et al., 2017), το οποίο, παρά την ύφεση που παρουσιάζει με την εφαρμογή ανοσοθεραπείας, πολύ συχνά υποτροπιάζει. Το μοντέλο παγκρεατικού καρκίνου σε γενετικά τροποποιημένα ποντίκια που θα χρησιμοποιηθεί για προκλινικές μελέτες έχει ήδη περιγραφεί (βλ. Ενότητα 1.1δ). Για ταχεία ανάπτυξη όγκων, ως μοντέλο καρκίνου του μαστού θα χρησιμοποιήσουμε ποντίκια, που ήδη μελετούμε και έχουμε διαθέσιμα, με γονότυπο Wap-cre/Pik3caH1047R/MMTV-Myc (Stratikopoulos et al., 2015). Ενώ οι όγκοι από διαγονιδιακή υπερέκφραση MYC στο μαστό (MMTV-Myc ποντίκια) έχουν Τ50 4 μήνες, και οι όγκοι από ενεργοποίηση του μεταλλαγμένου (στο εξόνιο 20, H1047R) γονιδίου της PI3-κινάσης έχουν Τ50 1.3 έτη (ποντίκια Wap-cre/Pik3caH1047R), ο συνδυασμός MYC και ογκογόνου PI3-κινάσης προκαλεί σε θηλυκά ποντίκια εμφάνιση καρκίνου του μαστού με Τ50 μόλις 1 εβδομάδα αφότου γεννήσουν. Σημαντικότατο προτέρημα αυτού του μοντέλου για προκλινικές δοκιμές υποψηφίων φαρμάκων είναι η ταχύτατη (εντός ημερών μετά στην ανάπτυξη όγκου) εμφάνιση μεταστάσεων στον πνεύμονα στο 85% των πειραματοζώων. Παρ’ όλο που γενετικά τροποποιημένα ποντίκια θα ήταν δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και για τους άλλους δύο τύπους νεοπλασμάτων (καρκίνος του πνεύμονος και μελάνωμα), λόγω περιοριστικών παραγόντων (κόστη, χρόνος, ανθρώπινο δυναμικό, διαθέσιμος χώρος στον οίκο πειραματοζώων κλπ.), ελήφθη η στρατηγική απόφαση να γίνει αξιολόγηση των ενώσεων με ξενομοσχεύματα. Ορθοτοπική μεταμόσχευση σε ανοσοανεπαρκή NOD/SCID ποντίκια με ενδοθωρακική ένεση κυττάρων της σειράς Α549 (KRASG12S) ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονος, με την οποία έχουμε ήδη εμπειρία (βλ. Εικόνα 2Δ), δημιουργεί ταχύτατα (Τ50=30 ημέρες) μη μικροκυτταρικό όγκο που δίνει (100%) μεταστάσεις στον άλλο πνεύμονα, στο μεσοθωράκιο και στο θωρακικό τοίχωμα. Εάν ο χρόνος το επιτρέψει, θα γίνει επίσης μία προσπάθεια να πιστοποιηθεί (τουλάχιστον προκαταρκτικά) αν η αντι-MYC αγωγή είναι δραστική και σε περίπτωση που το γονίδιο KRAS δεν είναι μεταλλαγμένο. Για τον σκοπό αυτό θα χρησιμοποιηθεί για ετεροτοπικά ξενοσμοσχεύματα η κυτταρική σειρά NCI-H1437 ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονος (KRAS φυσιολογικό). Η κυτταρική σειρά Α375 ανθρώπινου μελανώματος θα χρησιμοποιηθεί για ξενομεταμόσχευση υποδορίως στην λαγόνιο περιοχή. Τα κύτταρα αυτά φέρουν την μετάλλαξη BRAFV600E που απαντάται σε δερματικά μελανώματα με συχνότητα >50%. Με κατάλληλο αριθμό κυττάρων (106), ψηλαφητοί όγκοι αρχίζουν να εμφανίζονται σε 10 ημέρες μετά την ένεση και φθάνουν σε μέγιστο επιτρεπτό μέγεθος σε 19 ημέρες. Σε μεταμοσχεύσεις με Α375 κύτταρα έχουν παρατηρηθεί και μικρομεταστάσεις, ιδίως στους πνεύμονες. Έχει ήδη αναφερθεί ότι οι προκλινικές δοκιμές στους 4 τύπους μοντέλων καρκίνου/ξενομοσχευμάτων θα αξιολογήσουν την θεραπευτική δράση 4-5 υποψηφίων αντι-ΜYC φαρμάκων που θα έχουν τελικά επιλεγεί (συνολικά, 16-20 δοκιμές). Σε κάθε δοκιμή, η ανάπτυξη του όγκου στα πειραματόζωα που θα υποβληθούν σε θεραπεία (n=10) θα συγκριθεί με εκείνη σε ζώα του ίδιου τύπου στα οποία θα χορηγηθεί μόνο ο διαλύτης του φαρμάκου (ομάδα ελέγχου, controls n=5-10), με εξαίρεση την περίπτωση του παγκρεατικού καρκίνου (η χορήγηση φαρμάκου γίνεται σε ετοιμοθάνατα ζώα και, συνεπώς, δεν υπάρχει ομάδα ελέγχου). Σύμφωνα με την πείρα μας, επειδή οι περισσότερες ενώσεις δεν είναι υδατοδιαλυτές, είναι ακατάλληλες για παρεντερική χορήγηση (π.χ. με ενδοπεριτοναϊκή ένεση). Έχουμε λύσει το πρόβλημα αυτό και χορηγούμε από του στόματος με διασωλήνωση (gavage) ένα αιώρημα που δημιουργείται με ανάδευση υπό την επίδραση υπερήχων (sonication) μετά από προσθήκη στερεάς ενώσεως σε υδατικό διάλυμα 0.5% καρβοξυμεθυλοκυτταρίνης. Τα υποψήφια φάρμακα χορηγούνται μία φορά ημερησίως συνήθως σε δόση 25% κατώτερη της μέγιστης ανεκτής που έχει καθοριστεί από πιλοτικά πειράματα σε ποντίκια ελέγχου. Το μέγεθος των ψηλαφητών όγκων (π.χ. καρκίνος μαστού ή υποδόρια ξενομοσχεύματα) παρακολουθείται κατά την διάρκεια της θεραπείας με μετρήσεις των διαμέτρων με παχύμετρο (caliper) και εφαρμογή του τύπου π/6xαxβ2 (όπου α και β είναι, αντιστοίχως, η μεγάλη και μικρή διάμετρος του όγκου). Η παρακολούθηση εσωτερικών καρκίνων (π.χ. παγκρέατος, πνεύμονος, μεταστάσεων) γίνεται με μικρο-ποζιτρονική τομογραφία (microPET/CT) στην υποδομή που διαθέτουμε. Για να ληφθούν αξιόπιστα αποτελέσματα, προβλέπεται ότι η θεραπευτική αγωγή θα έχει διάρκεια μεταξύ 3 εβδομάδων και 3 μηνών. Ακολούθως, τα πειραματόζωα θα θυσιάζονται για ιστολογικές και μοριακές αναλύσεις των καρκίνων ή των υπολειμμάτων τους. Ζώα που χάνουν βάρος, είναι εξαντλημένα από την ασθένεια ή ετοιμοθάνατα (όπως αναμένεται κυρίως για την ομάδα ελέγχου) θα θυσιάζονται πριν από το πέρας της περιόδου θεραπευτικής αγωγής για να μην υποφέρουν. Ένας υπολογισμός στατιστικής ισχύος για παράλληλες μελέτες, όπως οι δικές μας, δείχνει ότι υπάρχει 92% πιθανότητα να διαπιστώσουμε μια σημαντική διαφορά στο επίπεδο 0,05 χρησιμοποιώντας 14 ποντίκια, αν η διαφορά σε δραστικότητα ανάμεσα στο φάρμακο και στο διαλύτη είναι διπλάσια από την τυπική απόκλιση. Επειδή τα αποτελέσματά μας θα πρέπει να είναι πολύ πιο δραματικά από αυτό το μέγεθος για να είναι χρήσιμα, ομάδες 10 ζώων θα είναι επαρκείς.
(ι) Εμπορική αξιοποίηση του αντι-ΜΥC φαρμάκου Παράλληλα με την βελτιστοποίηση των μορίων αντι-MYC θεραπείας, θα γίνει και σημαντική προσπάθεια για την εμπορική αξιοποίηση των αποτελεσμάτων της πρότασης. Η εταιρία ProtATonce είναι μια εξωστρεφής επιχείρηση προκλινικών υπηρεσιών ανάπτυξης φαρμάκων ( >95% του τζίρου προέρχεται από το εξωτερικό). Έχει λοιπόν γνώση της αγοράς μέσω των υπηρεσιών που προσφέρει για την στόχευση και ανάπτυξη βιοδεικτών τόσο σε μεγάλες φαρμακοβιομηχανίες όσο και σε μικρές εταιρίες. Η θυγατρική της εταιρία Protavio Ltd με έδρα την Αγγλία συστεγάζεται στο τεχνολογικό πάρκο Stevenage Bioscience Catalyst με πλήθος άλλων μικρών εταιριών ανάπτυξης φαρμάκων. Η προσπάθεια εμπορικής αξιοποίησης των αποτελεσμάτων θα προχωρήσει όπως περιγράφεται κατωτέρω στην Ενότητα 1.5.