Πρόοδος του ΑΚΜΥ

Ι.ΙΒ.Ε.Α.Α.

Ο Φορέας για τις ανάγκες του παραδοτέου Π1.1, στην τελική περίοδο πιστοποίησης, πραγματοποίησε προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής με ανάλογα του AMY22 και ενώσεις της σειράς VM σε πεπτίδιο Myc για την αξιολόγηση της πρόσδεσης των υποψήφιων μορίων στην Myc. Πραγματοποιήθηκαν προσομοιώσεις Μοριακής Δυναμικής χρησιμοποιώντας το λογισμικό Desmond (Schrodinger Inc) σε 66 ανάλογα του AMY22 καθώς και σε 29 ενώσεις της σειράς VM για την αξιολόγηση της ικανότητας των μικρών μορίων να προσδεθούν στην c-Μyc. H υπόθεση εργασίας είναι ότι εάν ένα μικρό μόριο προσδένεται σταθερά στη c-Myc σε συνάρτηση με το χρόνο, τότε θα αναστέλλει τον ετεροδιμερισμό της c-Myc με την Max και συνεπώς θα αναστέλλει και τη μεταγραφική δράση της c-Myc. Για την επικύρωση της καταλληλότητας της Μοριακής Δυναμικής ως μεθόδου για την πρόβλεψη της ικανότητας μικρών μορίων να παραμένουν προσδεδεμένα σταθερά στην αλληλουχία c-Myc402-412, χρησιμοποιήθηκαν αρχικά 10 γνωστοί αναστολείς της c-Myc οι οποίοι χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες με βάση την ικανότητα πρόσδεσης των μορίων στο πεπτίδιο c-Myc402-412. Τέλος, για τις ανάγκες του Π1.1 πραγματοποιήθηκε υπολογισμός φυσικοχημικών και φαρμακολογικών ιδιοτήτων ADME των ενώσεων που παρουσιάστηκαν στην ΕΕ1 χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό QikProp. Για τις ανάγκες του Π1.4 το Τμήμα Φαρμακευτικής ως υπεργολάβος του έργου παρέδωσε 208 μόρια. Τα 63 από αυτά ήταν ενώσεις οι οποίες επελέγησαν με βάση την αρχή της φαρμακο-ομοιότητας από υπάρχουσες βιβλιοθήκες και συγκεκριμένα του NCI και του Τμήματος. Επίσης 145 νέα μόρια σχεδιάστηκαν, συντέθηκαν και παραδόθηκαν στην κοινοπραξία. Από τα νέα μόρια 38 έδειξαν δράση σε cell-based δοκιμασίες και 13 έδειξαν ενδιαφέρον θεραπευτικό παράθυρο. Για τα 8 από αυτά η δράση επιβεβαιώθηκε σε cell-free in-vitro δοκιμασίες. Για 5 από τα νέα μόρια αναπτύχθηκε scale-up διαδικασία και παρεδόθησαν ποσότητες της τάξεως των γραμμαρίων. 

Ο Φορέας επίσης ολοκλήρωσε τις απαραίτητες ενέργειες για την ολοκλήρωση του Π2.5., σχετικά με τον in-vitro καθορισμό της δραστικότητας (τιμής IC50) των υποψηφίων αντι-MYC φαρμάκων σε κυτταρικές καλλιέργειες.
Η επίτευξη των τελικών αυτών προϋποθέσεων στηρίζεται στην ανακάλυψη και περιγραφή αντι-Myc υποψηφίων φαρμάκων που η ανασταλτική τους δράση είναι όχι μόνο ισχυρή και ειδική, αλλά έχει επίσης σημαντικό θεραπευτικό εύρος (therapeutic window).
Για τις ανάγκες του Π2.5, χρησιμοποιώντας καλλιέργειες ενός καταλλήλου ζεύγους κυττάρων με το ίδιο γονιδίωμα εκτός από την παρουσία ή έλλειψη ενεργού γονιδίου Myc, αξιολογήθηκαν in vitro 212 ενώσεις για πιθανή καταστολική δράση εναντίον της ογκοπρωτεΐνης Myc, 17.5% από τις οποίες (37/212) επέδειξαν αντι-Myc δραστικότητα με IC50<10 μΜ.

Το ΙΙΒΕΑΑ, στα πλαίσια του Π4.1, πραγματοποίησε φαρμακολογικές μελέτες μορίων που σχετίζονται με τη στόχευση της ογκοπρωτεΐνης c-Myc. Η έκφραση της c-Myc χρησιμοποιήθηκε ως πιθανός συνοδευτικός βιοδείκτης αποτελεσματικότητας των μορίων στα πλαίσια των μελετών φαρμακοδυναμικής τους. Παράλληλα υλοποιήθηκε η βελτιστοποίηση της βιοαναλυτικής μεθοδολογίας υγρής χρωματογραφίας συζευγμένη με φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS) για την ανίχνευση μορίων, όπως το Amy22, Myci23, σε βιολογικά υγρά μυών (ολικό αίμα). Τα παραπάνω πειράματα οδήγησαν στη φαρμακοκινητική μελέτη των επιλεγμένων μορίων. Από τις μελέτες παρατηρήθηκε ότι ένας βασικός περιορισμός που εμποδίζει το δυναμικό του Myci23S είναι η σχετικά χαμηλή διαλυτότητά του.

Για τις ανάγκες του Π4.2 ο Φ2 πραγματοποίησε in vivo αξιολόγηση του Μyci23S σε ποντίκια με παγκρεατικό καρκίνο, in vivo αξιολόγηση του Μyci23S σε ξενομοσχεύματα κυττάρων Panc1, in vivo αξιολόγηση του Μyci23S σε ξενομοσχεύματα κυττάρων MDA-231.

ITE

Η επιστημονική ομάδα του ΙΤΕ, για τις ανάγκες του Π2.1 πραγματοποίησε έλεγχο της δυνατότητας των χημικών ενώσεων του ΑΚΜΥ να παρεμποδίζουν το σχηματισμό του διμερούς MYC/ΜΑΧ και να συνδέονται (direct binding) με την MYC ογκοπρωτεΐνη. Η μελέτη αυτή βασίστηκε σε Α. Βιοχημικές και Β. Βιοφυσικές μεθόδους. Για την επίτευξη του στόχου του Π2.1 παράχθηκαν σε βακτηριακές καλλιέργειες και σε διάφορες μορφές οι περιοχές bHLHZ των πρωτεϊνών ως ανασυνδυασμένα πολυπεπτίδια. Στην ενότητα των Βιοχημικών Τεχνικών (Α) ανέπτυξε μια in vitro δοκιμασία, απουσία κυττάρων, για προσδιορισμό της ανασταλτικής δράσης μικρών χημικών μορίων έναντι του σχηματισμού του πρωτεϊνικού συμπλόκου MYC/MAX. H μέθοδος βασίζεται στην τεχνική της συγκατακρήμνισης και ο προσδιορισμός της ανασταλτικής δράσης γίνεται με ανοσοαποτύπωση σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, ανάλυση κατά Western και επώαση με αντίσωμα έναντι της MAX. Μάλιστα, με χρήση του υπολογιστικού προγράμματος ImageJ είναι δυνατή η μετατροπή των ποιοτικών δεδομένων (ζώνες της His-MAX στη μεμβράνη), που λαμβάνονται από τη δοκιμασία Western blot, σε ημι-ποσοτικά, μετά τον υπολογισμό της οπτικής πυκνότητας των ζωνών της MAX πρωτεΐνης. Επιπλέον, αξιολογήθηκαν συνολικά 35 μόρια, από όπου ταυτοποιήθηκαν μόρια με ιδιαίτερα υψηλή ανασταλτική δράση, όπως τα μόρια Myci23S, Myci59, και Myci63, που προκαλούν αναστολή σχηματισμού του συμπλόκου GST-MYC/His-MAX έως 90% με 100%. Οι βιοφυσικές τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν οδηγούν σε συγκεκριμένα συμπεράσματα όσον αφορά την πρόσδεση (ή μη) μιας χημικής ένωσης στη MYC (φθορισμομετρία απόσβεσης και θερμοφόρηση μικροκλίμακας), το σχηματισμό και τη δομική ακεραιότητα του ετεροδιμερούς MYC/MAX και την αποσταθεροποίησή του παρουσία Myci23S (CD) και αξιοποιήθηκαν για τον έλεγχο των χημικών ενώσεων, μεταξύ αυτών ενώσεων προτύπων ή οδηγών.
Οι πιο δραστικές ενώσεις ως προς την πρόσδεση στη MYC και την αναστολή του σχηματισμού του συμπλόκου MYC/MAX επελέγησαν με κριτήριο το μέγεθος της μεταβολής φθορισμού όταν στη MYC προστίθεται η χημική ένωση (σε πειράματα MST) και τη διαφορά στην ένταση του σήματος CD.

Protatonce LTD

Στα πλαίσια του Π2.2 η επιστημονική ομάδα του ΑΚΜΥ δημιούργησε νέες πειραματικές μεθόδους για τον υπολογισμό της βιωσιμότητας κυτταρικών σειρών με και χωρίς MYC και κυτταρικών σειρών που εξαρτώνται και δεν εξαρτώνται από το MYC. Στα πλαίσια του παραδοτέου αναπτύχθηκαν οι εξής τεχνικές:
• High Content Screening με τη χρήση αλγορίθμων ανάλυσης εικόνων.
• Resazurin Assay για κυτταρική βιωσιμότητα.
• CCK-8 για τον υπολογισμό της τιμής της συγκέντρωσης IC50.
Χρησιμοποιώντας τις παραπάνω τεχνικές εξετάστηκε η δράση 133 αντι-MYC μορίων και βρέθηκαν συγκεκριμένες ενώσεις που παρουσιάζουν σημαντικό θεραπευτικό έυρος μεταξύ των κυτταρικών σειρών TGR1 και HO1519. Μεταξύ αυτών, και η ένωση Myci23S που αποτελεί lead μόριο της κοινοπραξίας του ΑΚΜΥ. Η επιστημονική ομάδα του ΙΙΒΕΑΑ ανέλαβε επιπλέον την in-vitro αξιολόγηση των αντι-MYC μορίων σε οργανοειδή παγκρεατικού καρκίνου ασθενών και ανέδειξε τη δραστικότητα της ένωσης Myci23S.
Για τις ανάγκες του Π2.3 ο Φ1 ανέπτυξε επιτυχώς μια σειρά 3 διαφορετικών μεθόδων εκτίμησης ηπατοτοξικότητας, χρησιμοποιώντας τα ήδη γνωστά ηπατοτοξικά φάρμακα Amiodarone και Acetaminophen για θετικά controls. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι τα ΑΜΥ22 και Mycii23S δεν προκαλούν ηπατοτοξικότητα.
Για τις ανάγκες του Π2.4 η επιστημονική ομάδα της ProtATonce LTD ανέπτυξε μια πολυπλεκτική δοκιμασία μέτρησης 20 πρωτεϊνών που συμμετέχουν καθοριστικά στην ενδοκυτταρική σηματοδότηση. Η πολυπλεκτική δοκιμασία που αναπτύχθηκε χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της επίδρασης των αντι-MYC μορίων του ΑΚΜΥ σε 4 καρκινικές κυτταρικές σειρές (Καρκίνος του πνεύμονα, μαστού, ήπατος και παγκρέατος). Συνολικά, εξετάστηκε η επίδραση των μορίων ΑΜΥ22, Mycro3, Myci23S, 10058-F4 και Tamoxifen (TMX) στην κυτταρική σηματοδότηση των καρκινικών μοντέλων. Από τα αποτελέσματα των μετρήσεων σηματοδοτικών πρωτεϊνών παρατηρούμε ότι το μόριο Myci23s, που αποτελεί το κύριο μόριο-οδηγό της σύμπραξης του ΑΚΜΥ επηρεάζει σημαντικά τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών ERK1 και JUN στην κυτταρική σειρά για καρκίνο του πνεύμονα και τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών P53, CREB1, MEK1 και AKTS1 στην κυτταρική σειρά ηπατικού καρκίνου. Οι επηρεαζόμενες πρωτεΐνες ανήκουν σε σηματοδοτικά μονοπάτια που βρίσκονται downstream του μεταγραφικού παράγοντα MYC και σχετίζονται άμεσα με τον κυτταρικό θάνατο (TNF signaling pathway), επιβεβαιώνοντας την επίδραση στο MYC και πιθανή αντικαρκινική δράση του Myci23S. 
Επιπλέον, για τις ανάγκες του Π2.6 ο Φ1 ανέπτυξε ένα καινοτόμο αλγόριθμος ανάλυσης δεδομένων γονιδιακής έκφρασης και σηματοδοτικών μονοπατιών για την επιλογή φαρμάκων που παρουσιάζουν σημαντική δράση σε κυτταρικά μοντέλα που υπέρ εκφράζουν το γονίδιο MYC και παρουσιάζουν αυξημένη δράση του μεταγραφικού παράγοντα. Τα φάρμακα που επιλέχθηκαν, ελέγχθηκαν πειραματικά σε κυτταρικές καλλιέργειες καρκινικών σειρών και έδειξαν σημαντικό παράθυρο δράσης μεταξύ των μοντέλων που είναι εξαρτόμενα από το MYC και των μοντέλων που είναι ανεξάρτητα. Επιβεβαιώθηκε έτσι, ότι η υπέρ-έκφραση του MYC μπορεί να λειτουργήσει ως συνοδευτικός βιοδείκτης για την ανταπόκριση σε άντι-MYC θεραπεία. Τέλος, για τις ανάγκες του Π5.1 ο Φ1 πραγματοποιήσε έρευνα της πνευματικής ιδιοκτησίας για τα αντι-MYC μόρια που αναπτύχθηκαν στο ΑΚΜΥ καθώς και για την ένωση AMY22.

ProRAD

Για τις ανάγκες του Π3.1 παρασκευάσθηκε σε ποσότητα 10g το κοινό ενδιάμεσο, από την οποία συνθέσαμε και παραδώσαμε, 4g του Myc-3 και επιπλέον άλλα 4g του Amy-22. 
Ακολουθώντας την μεθοδολογία που αναπτύξαμε στην πρώτη φάση του έργου, συνθέσαμε και παραδώσαμε, 4g του MYCI-19 και 3.5g του MYCI-O. Τέλος αναπτύχθηκαν δύο νέες πορείες για την σύνθεση των ενώσεων 1101 και 1118.
Στην τελευταία φάση του έργου, θεωρήθηκε σημαντικό να εξεταστεί μία άλλη κατηγορία ετεροκυκλικών δακτυλίων παρόμοια με το VΜ_17. Η pro-RaD ανέπτυξε και βελτιστοποίησε μία συνθετική μέθοδο για την παρασκευή της ένωσης αυτής σε κλίμακα γραμμαρίων. Το VΜ_17 που παραδώσαμε χρησιμοποιήθηκε ως πρώτη ύλη από την ομάδα του Δημόκριτου για τη σύνθεση διαφόρων αναλόγων τα οποία έδωσαν ενδιαφέροντα αποτελέσματα στα βιολογικά πειράματα που ακολούθησαν. Η ποσότητα που παραδόθηκε ήταν 8g.